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冷凍電鏡的基本原理與應(yīng)用

來源：本站時間：2020-08-24 16:36:41 瀏覽：19019次

作者：Green dinosaur

1 引言

先進(jìn)電子顯微技術(shù)為從微觀基礎(chǔ)上解析宏觀物質(zhì)的性質(zhì)提供了有力的技術(shù)支持，但受限于電子顯微鏡的工作原理，以及含大量水分的生物樣品的特殊性，它在生物科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。冷凍電子顯微技術(shù)（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）的現(xiàn)世為這一局限填補(bǔ)了空白，采用樣品冷凍——低劑量電子斷層掃描——三維重構(gòu)的方案，科學(xué)家們順利得到了大分子生物樣品的電子顯微相。而隨著硬件儀器和解析軟件的發(fā)展，冷凍電鏡的圖像分辨率大大提升，應(yīng)用范圍也得到了進(jìn)一步擴(kuò)展，不僅限于生物材料結(jié)構(gòu)研究，還可用來廣泛研究對電子束、熱敏感的特殊材料。冷凍電鏡也將于未來在材料科學(xué)研究領(lǐng)域里開辟出一片嶄新的天地。

2 前世今生——冷凍電子顯微技術(shù)的歷史

2017年10月4日，諾貝爾化學(xué)獎被授予冷凍電鏡領(lǐng)域的3位科學(xué)家，以褒獎他們在“開發(fā)冷凍電鏡用以高分辨率測定溶液中生物分子的結(jié)構(gòu)”方面的貢獻(xiàn)。這條消息甫一公布，就引起了人們的調(diào)侃，稱：“冷凍電鏡是授予物理學(xué)家的化學(xué)獎以獎勵他們對生物領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)?！边@一獎項(xiàng)的頒布將冷凍電子顯微帶入了大眾的視野，更體現(xiàn)了生物與物理、數(shù)學(xué)和計算機(jī)技術(shù)的多學(xué)科融合帶來的技術(shù)突破。

回顧冷凍電子顯微鏡的誕生歷程，我們會發(fā)現(xiàn)多學(xué)科技術(shù)融會貫通所帶來的神奇靈感碰撞。

圖1 2017年諾貝爾化學(xué)獎獲得者

2017年諾貝爾化學(xué)獎獲得者

1924年，“物質(zhì)波”假說的提出奠定了電子顯微技術(shù)的基礎(chǔ)，經(jīng)過長足的發(fā)展與應(yīng)用，以掃描電子顯微鏡（SEM）與透射電子顯微鏡（TEM）為主的電子顯微儀器在對樣品的結(jié)構(gòu)解析與微觀成分表征都發(fā)揮了強(qiáng)大的實(shí)力，但卻在生物材料領(lǐng)域碰了壁，這是由于：

（1）高能入射電子束會對生物樣品造成輻射損害，嚴(yán)重破壞樣品的結(jié)構(gòu)；

（2）生物樣品中通常含有豐富的水分，在高真空環(huán)境下水分脫出會嚴(yán)重破壞電子束傳播，同時造成樣品結(jié)構(gòu)的崩塌；

（3）生物樣品主要由C、O、N、H等輕質(zhì)元素組成，成像襯度很低，產(chǎn)出圖像的質(zhì)量受到了限制。

20世紀(jì)50年代，人們采用負(fù)染色技術(shù)來固定生物結(jié)構(gòu)并對其進(jìn)行電鏡觀察。這種實(shí)驗(yàn)方法操作簡單，圖像襯度高，但獲得的電鏡照片分辨率只能達(dá)到十幾埃左右。

1974年，Kenneth A.Taylor和Robert M.Glaeser在-120℃觀察生物樣品時成功獲取了冷凍水合過氧化氫酶的高分辨圖像信息^[2]。這個工作中發(fā)現(xiàn)了冷凍樣品有助于減低樣品的輻照損傷，標(biāo)志著冷凍電鏡應(yīng)用于生物物理學(xué)領(lǐng)域的開始。

1980年，Jacques Dubochet在薄膜純水玻璃化的制備技術(shù)上取得了突破性的進(jìn)展^[3]。他采用的液態(tài)乙烷浴冷凍法具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，一直沿用至今。

由于透射電鏡只能獲得二維投影圖像，需要建立算法邏輯，搭建起二維圖像與三維結(jié)構(gòu)的映射關(guān)系。

1968年，Aaron Kulg提出了從二維圖像重構(gòu)三維物體的基本數(shù)學(xué)原理，也稱中心界面定理，奠定了三維重構(gòu)技術(shù)的基礎(chǔ)^[4]。

1987年，Max Radermacher和Joachim Frank等人提出了斷層掃描成像法和單顆粒分析法^[5]。單顆粒分析技術(shù)能夠嚴(yán)格控制對樣品的輻照損傷，是今天冷凍電鏡領(lǐng)域廣泛使用的大分子結(jié)構(gòu)解析方法的基礎(chǔ)。

2008年，加州大學(xué)洛杉磯分校的周正洪教授通過一萬兩千多張單顆粒圖像，成功獲得了3.9?分辨率的CPV病毒三維結(jié)構(gòu)^[6]。這是第一次通過單顆粒冷凍電鏡重構(gòu)技術(shù)得到近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。

2013年以來，由于電子直接探測器（Direct electron-detector device，DDD）的發(fā)展，冷凍電鏡取得了革命性的進(jìn)步。加州大學(xué)舊金山分校程亦凡教授研究組成功利用新一代DDD相機(jī)解析得到了瞬時受體電位通道蛋白（TRPV1）的3.4?分辨率結(jié)構(gòu)^[1]。這項(xiàng)研究打破了不結(jié)晶膜蛋白側(cè)鏈的分辨率屏障，展示了單顆粒冷凍電鏡在膜蛋白分析上的巨大潛力。

3 廬山真面——冷凍電子顯微鏡的原理與結(jié)構(gòu)

冷凍電子顯微技術(shù)的發(fā)展與完善經(jīng)歷了復(fù)雜而艱辛的探索，下面，我們將深入解析冷凍電子顯微鏡的工作原理、流程與儀器結(jié)構(gòu)，揭開它的廬山真面目。

3.1工作原理

3.1.1 樣品制備：樣品快速冷凍技術(shù)

樣品的原位冷凍固定處理是低溫電子顯微鏡標(biāo)本制備的第一步，其過程如下圖所示^[7]。

圖2 原位冷凍固定示意圖

原位冷凍固定示意圖^[7]

冷凍電鏡采用的快速冷凍技術(shù)關(guān)鍵在于“快速”。這是由于：采用常規(guī)冷凍手段，水分子會在氫鍵作用下形成冰晶，一來會改變樣品結(jié)構(gòu)，二來在成像過程中，冰晶體會產(chǎn)生強(qiáng)烈的電子衍射掩蓋樣品信號。而當(dāng)冷凍速率足夠快時，水分子在形成晶體之前就會凝固成無定形的玻璃態(tài)冰，具有非晶態(tài)特性，保證了在電子束探測成像的過程中不會對樣品成像造成干擾。

冷凍固定時，樣品首先放置在由液氮冷卻的容器中，隨后被快速浸入液態(tài)乙烷中。采用液態(tài)乙烷作為冷凍劑的目的是為了使冷凍速率足夠快，在冷凍過程中，樣品將以每秒104至106 K的速度被快速冷卻。生物樣品中的水被玻璃化冷凍后，樣品結(jié)構(gòu)就得到了保持和固定，同時玻璃化冰也不會在真空環(huán)境中揮發(fā)，在一定程度上保護(hù)了樣品免受電子輻射的損傷。

3.1.2 樣品成像：低劑量輻照成像

普通的樣品材料在進(jìn)行TEM表征時，電子劑量越高，成像質(zhì)量越好。但生物樣品受到的輻照損傷卻是和累積的輻照總劑量相關(guān)的。更詳細(xì)一點(diǎn)說，隨著輻照劑量的增加，輻照損傷對高分辨細(xì)節(jié)的破壞更嚴(yán)重。因此，為了盡可能地獲得更多的細(xì)節(jié)，就必須要對樣品采用用低劑量輻照成像。

在冷凍電鏡技術(shù)中，常用的低劑量輻照成像法有兩種：冷凍電子斷層掃描法，單顆粒分析成像法。

（1）電子斷層掃描技術(shù)（cryogenic computed tomography）

圖3 電子斷層掃描技術(shù)示意圖

電子斷層掃描技術(shù)示意圖^[8]

（2）單顆粒分析法（Single particle analysis, SPA）

單顆粒技術(shù)獲得投影的具體方法如圖4：制備很多具有同樣結(jié)構(gòu)的大分子樣品，將其進(jìn)行分散冷凍后進(jìn)行隨機(jī)的投影拍照，再通過計算模擬測定角度，對具有相同角度的粒子進(jìn)行組合，突出其中更特殊、更容易解釋的特征。

單顆粒冷凍電鏡是針對單個粒子進(jìn)行重構(gòu)的技術(shù)，但我們的研究對象往往是多構(gòu)象或結(jié)構(gòu)異質(zhì)的蛋白，顆粒之間存在細(xì)微差別，這是一些蛋白質(zhì)無法獲得高分辨結(jié)構(gòu)的重要原因之一。對于結(jié)構(gòu)異質(zhì)性樣品的分析，我們需要首先將樣品分成幾個同質(zhì)的子集，然后分別進(jìn)行三維重建。

由于單顆粒分析法理論成像分辨率更高，尤其在分析具有同質(zhì)性結(jié)構(gòu)的樣品時表現(xiàn)出更方便、更優(yōu)異的成像能力，因此得到了更廣泛的應(yīng)用。單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可是不具有任何對稱性的蛋白分子或復(fù)合體，尤其是針對核糖體的表征。

圖4 單顆粒分析圖像重建

單顆粒分析圖像重建^[9]

（3）電子斷層掃描技術(shù)與單顆粒分析法的比較：

單顆粒分析法：

優(yōu)點(diǎn)：解析生物大分子的理論分辨率可達(dá)原子級；樣品受總輻射值??；對稱顆粒的解析分辨率更高；分子量越大，結(jié)果越好；

缺點(diǎn)：對樣品的重復(fù)性有非?？量痰囊?，只能用于對經(jīng)過提純的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的生物大分子的三維重構(gòu)。

電子斷層掃描技術(shù)：

優(yōu)點(diǎn)：簡單直接；對樣品的要求較低；常用于對細(xì)胞或者生物組織結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)；

缺點(diǎn)：對同一樣品位置多次拍照時，電子束對樣品的輻照損傷就成為了比較嚴(yán)重的問題；樣品旋轉(zhuǎn)角度受到電子束透過樣品厚度能力的限制。

3.1.3 三維重建

透射電子顯微鏡所成圖像是物體的投影像，類似于X射線光片。通過使用投影切片定理（圖5），可以組合從一個視角范圍拍攝的物體的許多圖像（2D投影）來生成物體的三維重建。

在理想的單顆粒成像條件下，玻璃冰中的蛋白質(zhì)隨機(jī)分布，如果使用了大量的粒子圖像，則可以實(shí)現(xiàn)各向同性的重建。這與電子斷層掃描相反，電子斷層掃描由于樣品的幾何形狀而限制了視角，從而實(shí)現(xiàn)了各向異性的重建。

三維結(jié)構(gòu)的傅里葉反演重建原理^[11]

3.2 工作流程

單顆粒冷凍電鏡的工作流程如下：

第１步：樣品制備。高純度、高濃度的蛋白樣品溶液被滴在一個特制的樣品載網(wǎng)上。載網(wǎng)由一張布滿小孔的超薄非晶碳薄膜和金屬支撐框架組成，在表面張力的作用下，微孔上會形成一層跨孔的薄水膜。將多余溶液吸走后，把載有蛋白溶液超薄膜的載網(wǎng)迅速投入到液態(tài)乙烷冷凍劑中使其快速冷凍，從而使蛋白質(zhì)分散固定在玻璃態(tài)的冰膜中。

第２步：電鏡圖像采集。選擇最有可能產(chǎn)生最佳圖像的最佳顆粒密度和玻璃態(tài)冰厚度的樣品，設(shè)定最佳的參數(shù)（比如：欠焦值、放大倍數(shù)和電子劑量等），記錄這些樣品區(qū)域的大量圖像，用手工或半自動程序框取那些離散的分子形成的投影圖。

第３步：三維結(jié)構(gòu)搭建。由于電子可能對非常敏感的樣品造成輻射損傷，所以單顆粒冷凍電鏡只能采用非常低的電子量，而這種電鏡2D投影圖像有非常大的背景噪聲。為提高圖像分辨率，研究人員首先需要提出一個初始的3D模型，然后對捕獲的單顆粒2D圖像進(jìn)行分選。

3.3 儀器結(jié)構(gòu)

冷凍電子顯微鏡的儀器結(jié)構(gòu)與透射電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)相似，只是在進(jìn)樣之前搭載了液態(tài)乙烷罐與冷凍倉，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉(zhuǎn)移至樣品倉內(nèi)。

圖7 冷凍電鏡的儀器結(jié)構(gòu)

冷凍電鏡的儀器結(jié)構(gòu)

（1）冷凍室：在實(shí)際操作中，向液態(tài)乙烷中投入樣品時，乙烷會在樣品周圍快速沸騰，形成絕緣氣態(tài)膜，減慢向低溫液體的熱傳遞，稱為萊頓弗羅斯特效應(yīng)。因此要使厚度超過幾微米的樣品中的水以足夠高的冷卻速度產(chǎn)生非晶冰非常困難。冷凍室中加入旋轉(zhuǎn)葉片真空泵將冷凍劑泵入，可以提高冷卻速度。

（2）電子槍：產(chǎn)生電子束的部分，聚光鏡系統(tǒng)負(fù)責(zé)將電子束聚焦到樣本樣品上。

（3）圖像生成系統(tǒng)：由物鏡，中間和投影儀鏡頭以及可移動平臺組成。

（4）圖像記錄系統(tǒng)：收集來自樣品的電子信號，在熒光屏上形成圖像。

3.4 優(yōu)勢與不足

冷凍電鏡已經(jīng)能解析出生物大分子的原子級分辨率（0.2-0.3 nm）結(jié)構(gòu)，但是這一結(jié)果離物理極限還有較大距離。并且基于生物大分子樣品的成像特殊性，目前依然存在如下不足。

（1）樣品制備的困難。樣品制備的關(guān)鍵要求是顆粒朝向必須是隨機(jī)分布的，但樣品制備過程操作會對顆粒的隨機(jī)分布造成影響。

（2）要求樣品結(jié)構(gòu)均一性。多個顆粒的圖像數(shù)據(jù)必須進(jìn)行合并和平均以形成3D重構(gòu)圖，若要實(shí)現(xiàn)高分辨率，就必須保持樣品結(jié)構(gòu)的均一。

（3）蛋白顆粒構(gòu)象多樣。理論上說，單顆粒冷凍電鏡的一大優(yōu)勢就在于能區(qū)別不同的功能構(gòu)象，但是有時候不同的構(gòu)象相似度太高，導(dǎo)致區(qū)別起來非常棘手。

（4）成像理論需要進(jìn)一步研究。冷凍電鏡現(xiàn)有的成像理論是一種數(shù)學(xué)上的近似法。如果要進(jìn)一步提高結(jié)構(gòu)解析的分辨率，就需要用到更為復(fù)雜的電鏡成像理論來提取圖像。近年來，在單顆粒分析中取得重大突破的是最大似然估計理論，它在圖像匹配、2D和3D分類與模型優(yōu)化上均有應(yīng)用，是一個強(qiáng)有力的理論工具。但過多的計算資源消耗阻礙了這個方法在冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)中的廣泛應(yīng)用，如何在加快計算速度的同時，提高模型重構(gòu)的準(zhǔn)確性是最大似然估計算法的一個重要問題。

4 大顯神通——冷凍電子顯微技術(shù)的應(yīng)用

4.1 結(jié)構(gòu)生物學(xué)

從歷史維度上看，冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的功勛建樹無需贅述。2020年年初，新型冠狀（2019-nCoV）病毒疫情席卷全球，冷凍電鏡技術(shù)在解析病毒結(jié)構(gòu)、推測其侵染人體細(xì)胞的路徑等傳播原理發(fā)揮了重要作用，為人類攻堅(jiān)疫情防護(hù)、研發(fā)疫苗提供了重要的理論依據(jù)。

圖8 2019-nCoV病毒與SARS病毒的結(jié)構(gòu)比較

2019-nCoV病毒與SARS病毒的結(jié)構(gòu)比較^[10]

病毒要進(jìn)入人體細(xì)胞，就必須與人體細(xì)胞上相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合。新冠肺炎疫情暴發(fā)以來，新冠病毒表面與宿主細(xì)胞作用的關(guān)鍵刺突蛋白（S蛋白，Spike glycoprotein）備受各研究團(tuán)隊(duì)的重視。得克薩斯大學(xué)的McLellan研究組采用冷凍電鏡技術(shù)，獲得純化S蛋白的3207張照片，結(jié)合已經(jīng)公開的新冠病毒序列，獲得了經(jīng)過3D重建的分辨率為3.5 ?的S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)^[10]。

研究團(tuán)隊(duì)將新冠病毒的結(jié)構(gòu)與其他幾種冠狀病毒進(jìn)行了比較。如圖8，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV的S蛋白整體結(jié)構(gòu)與SARS病毒S蛋白的整體結(jié)構(gòu)相似，各個結(jié)構(gòu)之間具有高度同源性。它們之間最大的差異是RBD在其各自的“向下”結(jié)構(gòu)中的位置差異。

結(jié)合冷凍電鏡獲取的病毒結(jié)構(gòu)與表面等離子共振技術(shù)（SPR）的分析結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)表明，新冠病毒的S蛋白結(jié)合人體ACE2（宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2）的親和力要遠(yuǎn)高于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的S蛋白，這解釋了為什么新冠病毒傳染性要比SARS病毒強(qiáng)得多。

4.2 材料科學(xué)

Stanford的崔屹教授2017年10月在Science發(fā)表了一篇使用低溫電鏡觀察電池中鋰負(fù)極材料和界面精細(xì)研究的文章，這是冷凍電鏡在材料學(xué)研究中應(yīng)用的一個開端^[11]。

鋰枝晶是鋰電池中最大的安全隱患，但鋰元素非?；顫姟Νh(huán)境敏感的特質(zhì)使得從原子層面解析鋰枝晶的生長機(jī)理成為一個極具挑戰(zhàn)的課題。傳統(tǒng)的TEM電子束能量很高，會嚴(yán)重?fù)p壞枝晶結(jié)構(gòu)，受到冷凍電鏡觀察敏感生物材料的啟發(fā)，崔屹教授等人使用冷凍電鏡技術(shù)首次獲得了鋰枝晶原子分辨率級別的結(jié)構(gòu)圖像。

圖9 鋰金屬直徑的原子分辨率級別TEM圖像

鋰金屬直徑的原子分辨率級別TEM圖像^[11]

與傳統(tǒng)電鏡觀察到的不規(guī)則形狀不同，高分辨的冷凍電鏡照片中顯示的鋰枝晶是呈長條狀的完美六面晶體，其生長行為顯示其有明顯的<111>優(yōu)先取向，也就是說，鋰枝晶生長過程中可能發(fā)生“拐彎”，但是并不會形成晶體缺陷。

崔屹教授的研究結(jié)果成功還原了鋰金屬在溫和環(huán)境下的結(jié)構(gòu)圖像，更貼近現(xiàn)實(shí)，而且證明冷凍電鏡測試技術(shù)可以有效地對脆弱、不穩(wěn)定的電池材料進(jìn)行高分辨率表征，例如鋰硅、鋰硫等，并且保持它們在真實(shí)電池中的原始狀態(tài)。

5 來日可期——總結(jié)與展望

長久以來，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域取得了巨大成功，目前，多構(gòu)象蛋白的三維分類問題和生物大分子的動力學(xué)分析依然是充滿挑戰(zhàn)的研究方向，新型的算法發(fā)展也將主要圍繞這些問題展開。而作為一種低信號源激發(fā)測試技術(shù)，冷凍電鏡技術(shù)在一些對電子束、熱敏感材料，如鈣鈦礦材料、某些高分子材料、水凝膠、量子點(diǎn)等精細(xì)結(jié)構(gòu)的物理表征與機(jī)理研究中也具有巨大的應(yīng)用潛力。他山之石，可以攻玉。隨著硬件設(shè)備與模擬算法的改進(jìn)，這項(xiàng)引領(lǐng)結(jié)構(gòu)生物化學(xué)研究邁入新紀(jì)元的技術(shù)，未來必定擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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