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精華|HPLC最實用的30個常見問題及對策（二）

來源：實驗與分析時間：2015-09-05 20:51:42 瀏覽：3786次

本文授權(quán)轉(zhuǎn)載自實驗與分析

精華|HPLC最實用的30個常見問題及對策（二）

鑒于HPLC在全行業(yè)運用越來越廣泛，每一個實驗室分析人員都應(yīng)該熟練掌握并應(yīng)用HPLC，為此，小編整理了約30條常見HPLC故障及對策分析方案，分為三天推送，今天是第二篇。昨日帖子有誤故而刪除，為您造成不便，敬請連接。

本文針對HPLC使用常見故障進行了較全面的分析,如輸液泵中的單向閥、泵墊圈、色譜柱、檢測器的常見故障,并結(jié)合日常工作實際,提出了一些可參考的做法和解決對策。以便使用者能及時注意所述問題,做到有問題及時解決,這樣既能大大延長儀器的使用壽命,又能使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。

HPLC常見故障因素

不規(guī)則的基線噪音產(chǎn)生原因

①漏液。 ②流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 ③流動相各溶劑不相溶 ④檢測器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 ⑥檢測器內(nèi)有氣泡 ⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。） ⑧檢測器燈能量不足 ⑨色譜柱填料流失或阻塞 ⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

以上相應(yīng)解決方法
①檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。 ②檢查流動相的組成。③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。 ⑤用強極性溶液清洗系統(tǒng) ⑥清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器 ⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 ⑧更換燈 ⑨更換色譜柱 ⑩維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置

保留時間漂移的故障排除

保留時間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時間漂移和保留時間波動。前者是指保留時間僅沿單方向發(fā)生變化，而后者指保留時間無固定規(guī)律的波動。將此兩種情況區(qū)分開來對找到問題的原因往往很有幫助。如，保留時間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時間的無規(guī)律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動相所致）等。

保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：

一、色譜柱平衡

如果我們觀察到保留時間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10-20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑（如離子對試劑）則需要相當(dāng)長的時間來平衡色譜柱。流動相污染也可能是原因之一。溶于流動相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動相成分。

二、固定相穩(wěn)定性

固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會慢慢水解。例如，硅膠基質(zhì)在pH4時水解穩(wěn)定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關(guān)。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩(wěn)定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多。經(jīng)常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解，如氨基鍵合相等。

三、色譜柱污染

保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱污染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷污染的來源。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能是使保留時間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì)。避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

四、流動相組成

流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動相等。

五、疏水坍塌

當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動相時，有時會發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或完全不保留的現(xiàn)象，這就是疏水坍塌。此現(xiàn)象是由流動相不浸潤固定相表面而致。挽救的辦法實現(xiàn)用含大量有機組分的流動相浸潤固定相，再用高水含量的流動相進行平衡。色譜柱長期儲存也會發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團的反相色譜柱（如Waters SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Waters Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌。

為何出現(xiàn)肩峰或分叉？

①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；

②樣品溶劑過強－－采用較弱的樣品溶劑；

③柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件；

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品；

⑤進樣器損壞－－更換進樣器轉(zhuǎn)子。

為何出現(xiàn)鬼峰？

①進樣閥殘余峰－－每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗；

②樣品中未知物－－處理樣品；

③柱未平衡－－重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑（尤其是離子對色譜）；

④三氟乙酸（TFA）氧化－－每天新配,用抗氧化劑；

⑤水污染（反相）－－通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水。

為何出現(xiàn)峰拖尾？

①柱超載－－降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相；

②峰干擾－－清潔樣品,調(diào)整流動相；

③硅羥基作用－－加三乙胺,用堿致鈍化柱,增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,純化樣品；

④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效－－更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品；

⑤柱塌陷或形成短路通道－－更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件；

⑥死體積或柱外體積過大－－連接點降至最低,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細內(nèi)徑的連接管；

⑦柱效下降－－用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱。

除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變？

改變流動相組成和溫度；改變柱長、柱內(nèi)徑和填料粒度；柱突然阻塞壓力升高（正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的）。

什么是強溶劑、弱溶劑？

改變流動相的組成或溶劑溶劑強度就可以改變峰容量因子和保留時間。在一定條件下，減少保留時間或縮短分析時間的溶劑為強溶劑，增加保留時間或延長分析時間的溶劑為弱溶劑。

怎樣才會使峰位發(fā)生重排？

在分析多組分樣品時，僅改變流動相的強度（組成百分比）而不改變其組成，一般僅僅改變所有組分的保留時間，不會發(fā)生峰位的重排。

下列條件改變可能發(fā)生峰位重排：流動相中換了強溶劑；PH值的改變；柱填料的改變；柱溫的改變；流動相的組成改變（如加入離子對試劑三乙基胺等）。

除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些？

加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持；氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多；真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失；超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。

評價一個色譜柱的最基本指標(biāo)有那些？

評價一根色譜柱的基本指標(biāo)是：塔板數(shù)、峰不對稱因子、柱壓降、適用范圍和鍵合相濃度以及峰容量。

為何出現(xiàn)峰展寬？

①樣品體積過大－－用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15% ；

②在進樣閥中造成峰擴展－－進樣前后排出氣泡以降低擴散；

③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢－－設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點；

④檢測器時間常數(shù)過大－－設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10% ；

⑤流動相粘度過高－－增加柱溫,采用低粘度流動相；

⑥檢測池體積過大－－用小體積池,卸下熱交換器；

⑦保留時間過長－－等度洗脫時增加強溶劑含量,也可用梯度洗脫；

⑧柱外體積過大－－將連接管徑和連接管長度降至最?。?

⑨樣品過載－－進小濃度小體積樣品。

免責(zé)聲明：本資源來源于實驗與分析，版權(quán)歸原作者所有，本文僅作交流學(xué)習(xí)之用，不作任何商業(yè)用途，若有侵權(quán)，請聯(lián)系刪除，謝謝理解！

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