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測試表征系列丨一文詳解MTT法和CCK－8法測定細(xì)胞毒性和增殖的優(yōu)劣

來源：科學(xué)10分鐘時(shí)間：2021-07-01 14:38:03 瀏覽：14257次

MTT法檢測

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。

CCK-8法檢測

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一種基于WST-8（水溶性四唑鹽，一種類似于MTT的化合物）的細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒，用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測。在電子耦合試劑存在的情況下，WST被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料（formazan），甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。細(xì)胞若增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細(xì)胞，生成甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定吸光值（450nm）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算便可以獲得細(xì)胞毒性相關(guān)數(shù)據(jù)。

CCK-8與MTT比較

（1） CCK-8 試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全，重現(xiàn)性好的細(xì)胞增殖與活性檢測方法。與傳統(tǒng)的MTT相比，無需有機(jī)溶劑和放射性同位素，步驟少，無損失，結(jié)果準(zhǔn)確！

（2）MTT 實(shí)驗(yàn)生成的甲瓚不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有機(jī)溶劑溶解后才能檢測；而CCK-8法產(chǎn)生的甲瓚是水溶性的，不僅省去了溶解的步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

（3）與 MTT 方法相比， CCK-8法線性范圍更寬，靈敏度更高。

（4）CCK-8法對細(xì)胞無毒性，可以多次測定，選取最佳測定時(shí)間。且CCK8法所用試劑在培養(yǎng)基中比 MTT 更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)效果重復(fù)性好。

（5）MTT 具有毒性，同時(shí)其生成的甲瓚需要有機(jī)溶劑溶解，溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)者也有損害，會(huì)對操作人員身體造成毒害，WST-8無毒，使用中無需有機(jī)溶劑，操作更加安全。

（6）CCK-8試劑盒在 4℃避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效。

CCK-8試劑使用方法

一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）

1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

2、按比例(例如:1/2 比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成細(xì)胞濃度梯度，一般要做 3-5 個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X 軸)，OD值為縱坐標(biāo) (Y 軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(適用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間要一致)。

二、細(xì)胞活性檢測

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37 °C， 5% CO2）。

2、向每孔加入 10 μL 的CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 OD 值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)。

4、用酶標(biāo)儀測定在 450nm 處的吸光度。

5、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

三、細(xì)胞增殖-毒性檢測

使用方法（以96孔板為例，其他規(guī)格培養(yǎng)板按實(shí)際情況安排）：

1、在96孔板中配制100μl的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100μl 2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔100μl 5000個(gè)細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度等因素決定）。按照實(shí)驗(yàn)需要，進(jìn)行培養(yǎng)（在 37 °C，5%CO2的條件下）預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。

2、向培養(yǎng)板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。

4、每孔加入10μl CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推?？梢杂眉恿讼鄳?yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和 CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會(huì)干擾檢測，則需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。

5、在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對于大多數(shù)情況，孵育 1 小時(shí)即可。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在 0.5、1、2 和4小時(shí)候分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm 的濾光片?？梢允褂么笥?00nm的波長，例如650nm，作為參考波長進(jìn)行雙波長測定。

7、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M 的 HCL溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在 24 小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

8、注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收可。

活力計(jì)算：

細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0 加藥） -A（空白）] ×100

A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培養(yǎng)基和 CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度

A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項(xiàng)：

1、使用 96 孔板進(jìn)行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，一定要注意培養(yǎng)基蒸發(fā)：一方面，由于 96 孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加 PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2、 CCK-8 檢測細(xì)胞活性的原理是通過檢測活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會(huì)干擾檢測，需設(shè)法去除。

3、建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

4、建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時(shí)，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加樣，溶液產(chǎn)生氣泡，會(huì)干擾OD值讀數(shù)。

5、當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000個(gè)/孔（100μl 培養(yǎng)基）。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2500 個(gè)/孔（100μl 培養(yǎng)基），且培養(yǎng)時(shí)間可適當(dāng)延長。如果要使用 24 孔板或 6 孔板實(shí)驗(yàn)，請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色已變化或 PH 值變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

7、如果沒有 450nm 的濾光片，可以使用吸光度在 430-490nm 之間的濾光片，但是 450nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

8、酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對檢測造成影響。

9、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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技術(shù)顧問劉老師：19113235271（微同）

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