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    毛細(xì)管電泳(CE,capillary electrophoresis),又稱高效毛細(xì)管電泳(HPCE,high performance capillary electrophoresis)或毛細(xì)管電分離法(CESM,capillary electro-separation method)。毛細(xì)管電泳包容電泳、色譜及其交叉內(nèi)容,是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,以樣品的多種特性(電荷、大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、相分配特性等)為根據(jù)的分離分析技術(shù)。毛細(xì)管電泳研究正在向多種前沿領(lǐng)域推廣應(yīng)用,其中 DNA 與 RNA 分析、復(fù)雜藥物分析、環(huán)境分析、醫(yī)學(xué)(特別是代謝組學(xué)與臨床醫(yī)學(xué))研究、蛋白質(zhì)組(多維)分離、糖組分析、手性分離、單細(xì)胞分析等工作進(jìn)展很快。

    1.毛細(xì)管電泳的基本理論

    一、電泳

    在電解質(zhì)溶液中,位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象,稱之為電泳。

    1808年,Reuss(俄國(guó))首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。

    1937年,Tiselius(瑞典)將電泳用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離:發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定;這是第一次實(shí)現(xiàn)自由溶液電泳,同時(shí)他也發(fā)明了第一臺(tái)電泳儀。

    1948年,Tiselius因?qū)﹄娪痉治龊臀椒椒ǖ难芯浚貏e是發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分而獲得1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

    二、傳統(tǒng)電泳

    利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫做電泳法或電泳技術(shù)。傳統(tǒng)電泳具有以下分類(lèi)

    (1)按形狀分類(lèi):U 型管電泳、柱狀電泳、板電泳。

    (2)按載體分類(lèi):濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳。

    傳統(tǒng)電泳分析,操作繁瑣,分離效率低,定量困難,因此無(wú)法與其它分析相比。1981年,Jorgenson 和 Luckas 用 75 μm 內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析,柱效高達(dá)40萬(wàn)/米,這促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革,迅速發(fā)展成為可與 GC、HPLC 相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)---毛細(xì)管電泳。

    三、毛細(xì)管電泳

    毛細(xì)管電泳在傳統(tǒng)電泳技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn):

    (1)采用了25-100 μm內(nèi)徑的毛細(xì)管。標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管的外徑為375 μm,有些管的外徑為160 μm。毛細(xì)管的特點(diǎn)是:容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL);側(cè)面/截面積比大,因而散熱快、可承受高電場(chǎng)(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì);在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。

    (2)采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā),大大減小了溫度效應(yīng),使電場(chǎng)電壓可以很高;電壓升高,電場(chǎng)推動(dòng)力大,又可以進(jìn)一步使柱徑變小,柱長(zhǎng)增加;毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于HPLC,理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米,特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。

    2.毛細(xì)管電泳的原理

    一、基本原理

    帶電離子在電場(chǎng)中定向移動(dòng)時(shí)不同的離子具有不同的遷移速度,物質(zhì)離子在電場(chǎng)中的差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。

    當(dāng)帶電離子以速度 v 在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí),受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力(FE=qE)和平動(dòng)摩擦阻力(F=fv)的作用,得到 qE = fv(q為離子所帶有效電荷,E為電場(chǎng)強(qiáng)度,v為離子在電場(chǎng)中的遷移速度,f為平動(dòng)摩擦系數(shù))。

    對(duì)于球形離子,f=6πηγ,所以遷移速度 v=qE/6πηγ。

    二、電滲透現(xiàn)象與電滲流

    在電泳過(guò)程中,當(dāng)固體與液體接觸時(shí),固體表面由于某種原因帶一種電荷,則因靜電引力使其周?chē)后w帶有相反電荷,在液-固界面形成雙電層(圖2),二者之間存在電位差。當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí),就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng),這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流(electroosmotic flow,簡(jiǎn)稱EOF)。

    圖2 雙電層示意圖

    電滲透的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì):

    (1)內(nèi)表面帶負(fù)電荷,溶液帶正電荷,電滲流流向負(fù)極

    (2)內(nèi)表面帶正電荷,溶液帶負(fù)電荷,電滲流流向正極

    以石英毛細(xì)管柱為例,內(nèi)充液pH>3時(shí),表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷,形成雙電層。在高電場(chǎng)的作用下,帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng),由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的,故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)。

    改變電滲流方向的方法:

    (1)毛細(xì)管改性:表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)。

    (2)加電滲流反轉(zhuǎn)劑:內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑,使石英毛細(xì)管壁帶正電,溶液表面帶負(fù)電。

    在毛細(xì)管電泳中,電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5-7倍,因此控制電滲流非常重要。陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致,陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反,中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致,如圖3所示。

    圖3 電滲流對(duì)電泳中離子遷移的影響

    3.毛細(xì)管電泳儀

    一、工作原理

    毛細(xì)管電泳儀以毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分的淌度(單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的遷移速度)和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)各組分分離。

    圖4 樣品的分離過(guò)程示意圖

    二、主要構(gòu)造

    毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源,一根毛細(xì)管,一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶,如圖5所示。

    圖5 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)基本構(gòu)造

    (1)高壓電源

    毛細(xì)管電泳儀的高壓電源是穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源;可恒壓(電壓范圍為0-30千伏)、恒流、恒功率輸出;具有電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng);電壓穩(wěn)定性達(dá)到0.1%;能做到電源極性易轉(zhuǎn)換。

    (2)毛細(xì)管柱

    毛細(xì)管是CE分離的心臟,理想的毛細(xì)管必須電絕緣、紫外/可見(jiàn)光透明和富有彈性,目前可以使用的有塑料管、玻璃管、石英管等,其中彈性熔融石英毛細(xì)管被普遍使用。毛細(xì)管柱內(nèi)徑一般為20-75 μm,外徑350-400 μm,長(zhǎng)度≤1m。

    毛細(xì)管上具有檢測(cè)窗口,一般使用的外涂聚酰亞胺的石英毛細(xì)管由于聚酰亞胺涂層不透明,必須使用硫酸腐蝕法、灼燒法、刀片刮除法等對(duì)涂層進(jìn)行剝離得到檢測(cè)窗口。

    (3)緩沖液池

    緩沖液池要求化學(xué)惰性,機(jī)械穩(wěn)定性好。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì),充填于緩沖液池和毛細(xì)管中,通過(guò)電極、導(dǎo)線與電源連通,是分離室中的導(dǎo)體。

    (4)檢測(cè)器

    檢測(cè)器要求具有極高的靈敏度,可柱端檢測(cè),檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化。CE具有多種檢測(cè)方法,比如光吸收法、電化學(xué)法、電導(dǎo)法、化學(xué)發(fā)光法、磷光法、熒光法、質(zhì)譜法等,其中紫外吸收已經(jīng)非常成熟,是絕大多數(shù)商品儀器的主力檢測(cè)手段,部分商品儀器采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法(LIF)和高頻電導(dǎo)檢測(cè)法(hfCD)。紫外吸收法既能采用柱上檢測(cè)方式(圖6),也可采用柱后檢測(cè)方式(圖7)。

    圖6 毛細(xì)管柱上檢測(cè)固定方法
    圖7 利用鞘流池進(jìn)行柱后紫外吸收檢測(cè)

    三、進(jìn)樣方式

    (1)壓力進(jìn)樣:壓力進(jìn)樣要求毛細(xì)管的填充介質(zhì)具有流動(dòng)性,比如溶液等。將毛細(xì)管的兩端置于不同壓力環(huán)境中時(shí),管中溶液即能流動(dòng),將樣液帶入。利用壓縮空氣可以實(shí)現(xiàn)正壓進(jìn)樣,并能和毛細(xì)管清洗系統(tǒng)共享,因此商業(yè)化的儀器常采用此法。壓力進(jìn)樣沒(méi)有偏向問(wèn)題,但選擇性差,樣品及其背景都同時(shí)被引進(jìn)管中,對(duì)后續(xù)分離可能產(chǎn)生影響。

    (2)電動(dòng)進(jìn)樣:當(dāng)把毛細(xì)管的進(jìn)樣端插入樣品溶液中并加上電場(chǎng)E時(shí),組分就會(huì)遷移進(jìn)入管內(nèi)。電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒(méi)有特別要求,能夠完全自動(dòng)化操作,也是商品儀器必備的進(jìn)樣方法。但是電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)離子組分存在進(jìn)樣差別,會(huì)降低分析的準(zhǔn)確性和可靠性。

    (3)擴(kuò)散進(jìn)樣:利用濃差擴(kuò)散原理可將樣品引入毛細(xì)管。擴(kuò)散進(jìn)樣對(duì)管內(nèi)介質(zhì)沒(méi)有任何限制,具有雙向性,在樣品分子進(jìn)入毛細(xì)管的同時(shí),管中的背景物質(zhì)也向管外擴(kuò)散,能抑制背景干擾,提高分離效率。

    四、分離方式

    毛細(xì)管電泳有許多不同的模式,因而在分離樣品前必須選擇合適的分離模式以達(dá)到最佳的分離結(jié)果。根據(jù)簡(jiǎn)單性原則,首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式,最后才考慮填充形式的分離模式,如圖8所示。

    圖8 毛細(xì)管電泳模式選擇流程

    不同的分離模式所采用的分離機(jī)理有所不同,如圖9所示。

    圖9 不同的毛細(xì)管電泳模式對(duì)應(yīng)的分離機(jī)理

    4.毛細(xì)管電泳的應(yīng)用

    毛細(xì)管電泳分析技術(shù)發(fā)展迅速,具有分離效率高、所需樣品少、應(yīng)用范圍廣、分析成本低等諸多優(yōu)點(diǎn),是生物化學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境分析中備受關(guān)注的分離分析技術(shù)之一。

    一、手性分析

    在現(xiàn)代社會(huì)中,與人類(lèi)健康息息相關(guān)的醫(yī)藥生產(chǎn)必須考慮手性問(wèn)題,國(guó)際科學(xué)界十分重視手性藥物的分離分析,毛細(xì)管電泳是一種簡(jiǎn)單高效的手性分析方法。

    實(shí)例:柯諾辛堿B(Corynoxine B)具有降壓,抗心律失常,保護(hù)腦缺氧缺血的作用??轮Z辛堿(Corynoxine)是柯諾辛堿B異構(gòu)體,在不同的神經(jīng)元細(xì)胞系誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,結(jié)構(gòu)如圖10所示。Zhiying Wang等人[1]以環(huán)糊精(HP- β -CD)和谷氨酸(TBA-L-Glu)用作分離系統(tǒng)的添加劑,建立了一種靈敏、快速,有效的方法,用于毛細(xì)管電泳中的場(chǎng)放大樣品堆疊(FASS),成功分離和測(cè)定鉤藤中的柯諾辛堿和柯諾辛堿B(圖11) 。

    圖10 柯諾辛堿和柯諾辛堿B的分子結(jié)構(gòu)圖
    圖11 不同樣品的毛細(xì)管電泳色譜圖:峰1為柯諾辛堿B,峰2為柯諾辛堿

    二、蛋白質(zhì)分析

    蛋白質(zhì)不僅是有機(jī)體的構(gòu)建材料,也是生物功能分子,如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、酶、抗體等。天然蛋白來(lái)自于基因分宜,但不一定能與基因一一對(duì)應(yīng),翻譯后的修飾、代謝、復(fù)合或絡(luò)合等過(guò)程會(huì)使蛋白質(zhì)分子的種類(lèi)復(fù)雜化,因此蛋白質(zhì)的分離分析是一個(gè)挑戰(zhàn)性的課題。毛細(xì)管電泳可用于蛋白質(zhì)分離研究中的諸多方面。

    實(shí)例:Huan-Huan Zhao等人[2]結(jié)合壓力介導(dǎo)微分析(PMMA)和毛細(xì)管電泳的毛細(xì)管電泳方法建立了電泳介導(dǎo)的微量分析(EMMA),如圖12所示,并將其應(yīng)用于α-葡萄糖苷酶的動(dòng)力學(xué)和抑制動(dòng)力學(xué)研究,以及從天然黃酮中篩選出α-葡萄糖苷酶抑制劑。

    圖12 電泳毛細(xì)管內(nèi)酶法測(cè)定過(guò)程示意圖

    三、DNA及其碎片分析

    從1988年毛細(xì)管電泳被用于DNA分析后,DNA分析中的測(cè)序、PCR產(chǎn)物鑒定、基因突變研究、DNA損傷分析、臨床診斷等都開(kāi)始大量使用毛細(xì)管電泳技術(shù)。

    實(shí)例:急性腹瀉在全球均有較高的發(fā)病率和死亡率,主要發(fā)生在兒童和老年人群。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見(jiàn)病毒包括輪狀病毒(rotaviruses,RV)、諾如病毒(norovirus,NoV)、腸道腺病毒(adenoviruses,Adv)、扎如病毒(sapovirus,SV)及星狀病毒(humanastroviruses,HAstV)。目前約40%的腹瀉并不能快速準(zhǔn)確診斷出病因。病毒的分離培養(yǎng)及鑒定周期較長(zhǎng),免疫學(xué)方法在窗口期通常不能反映現(xiàn)癥感染,而且單病原體的PCR方法檢測(cè)通量較低。

    蔡德豐等人[3]首次以兒童常見(jiàn)腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標(biāo),建立多重PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)體系,以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。5種病毒陽(yáng)性參考品擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳后均檢測(cè)到相應(yīng)片段,無(wú)明顯的干擾雜峰出現(xiàn),其他腹瀉病原體核酸對(duì)反應(yīng)體系無(wú)影響,見(jiàn)圖13。

    圖13 5種腹瀉病毒陽(yáng)性參考品毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

    四、糖及其綴合物分析

    糖是自然界中廣泛存在、被人類(lèi)長(zhǎng)期利用的化學(xué)物質(zhì)。糖不僅是動(dòng)植物的能源(儲(chǔ)能材料如糖元)和燃料,也是代謝過(guò)程的中間產(chǎn)物。在植物和微生物體中,糖是主要的結(jié)構(gòu)材料。糖也是糖綴合物的重要部件。已經(jīng)證明,糖及其綴合物在細(xì)胞識(shí)別以及其他生物分子識(shí)別中,具有不可替代的或直接的作用。糖及其綴合物的分析因此受到了越來(lái)越廣泛的重視。利用毛細(xì)管電泳分離糖首先必須解決電荷問(wèn)題。除糖醒酸、唾液酸、氨基糖以及一些硫酸化糖(硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素等)外,天然糖是不帶電荷的,不能在電場(chǎng)中遷移。理論上,可以采用絡(luò)合、解離、衍生等方法使糖帶電。

    實(shí)例:牛舌草為紫草科植物意大利牛舌草Anchusa italica Retiz.或琉璃苣Borage officinales L.的地上部分,是維吾爾醫(yī)治療心腦血管疾病的常用藥材之一,具有祛寒補(bǔ)心、爽心悅智、潤(rùn)燥消炎、止咳平喘等功效。多糖有顯著的免疫興奮、抗衰老、抗氧化活性和抗腫瘤等特性。研究牛舌草中的營(yíng)養(yǎng)成分,特別是其中的糖類(lèi)成分,對(duì)于深入研究其藥用價(jià)值具有重要意義。依明·尕哈甫等人[4]采用苯酚-硫酸法測(cè)定了牛舌草中多糖的含量,同時(shí)利用高效毛細(xì)管電泳法(HPLCE)測(cè)定了單糖組分(圖14),旨在為牛舌草的質(zhì)量評(píng)價(jià)和進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)該中藥資源提供有益參考。

    圖14 牛舌草多糖中單糖遷移時(shí)間、峰面積及峰面積百分含量

    五、毛細(xì)管電泳聯(lián)用及微流控芯片技術(shù)

    常規(guī)的毛細(xì)管電泳雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn),但是也存在一些問(wèn)題,比如(1) 由于進(jìn)樣量少,因而制備能力差;(2) 由于毛細(xì)管直徑小,使光路太短,用一些檢測(cè)方法(如紫外吸收光譜法)時(shí),靈敏度較低;(3)電滲會(huì)因樣品組成而變化,進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性。因此,毛細(xì)管電泳的聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品處理、分離和檢測(cè)具有重要的改進(jìn)作用。

    目前毛細(xì)管電泳的聯(lián)用技術(shù)主要分為分離-分離、分離-檢測(cè)、分離-鑒定、樣品處理-分離等類(lèi)型,比如二維(多維)毛細(xì)管電泳、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-核磁共振聯(lián)用、毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光聯(lián)用、流動(dòng)注射-毛細(xì)管電泳聯(lián)用等等。

    此外,微流控芯片技術(shù)也是毛細(xì)管電泳的一個(gè)重要發(fā)展方向。微流控芯片技術(shù)是把化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)分析過(guò)程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上, 自動(dòng)完成分析全過(guò)程。芯片毛細(xì)管電泳的通道雖有各種變化,但基礎(chǔ)是十字交叉結(jié)構(gòu),如圖15所示,將樣品置于連接進(jìn)樣通道的任一電極槽中,在通道兩端加上合適的電壓,離子樣品便會(huì)遷移經(jīng)過(guò)分離通道。欲分離時(shí),只需在垂直于進(jìn)樣通道的方向上施加電壓,位于交叉口的樣品就會(huì)進(jìn)入分離通道.關(guān)閉或降低進(jìn)樣通道兩端的電壓,可以使進(jìn)樣通道中的樣品不動(dòng)或向兩邊回遷,而進(jìn)入分離通道的樣品則向檢測(cè)窗口方向遷移并發(fā)生分離,經(jīng)LIF或其他檢測(cè)器檢出樣品信號(hào)。

    圖15 十字型電泳芯片結(jié)構(gòu)

    5.參考文獻(xiàn)

    [1] Zhiying W , Haitao G , Meng C , et al. Separation and determination of corynoxine and corynoxine B using chiral ionic liquid and hydroxypropyl-β-cyclodextrin as additives by field-amplified sample stacking in capillary electrophoresis. Electrophoresis 2018, 39, 2195–2201.

    [2] Zhao H H , Liu Y , Chen J . Screening of α-glucosidase inhibitors from natural flavonoids by in-capillary assay combining PMMA and EMMA. Analytical Methods, 2019, 11, 13712019.

    [3] 蔡德豐,陳運(yùn)生,朱純青等. 多重PCR-毛細(xì)管電泳檢測(cè)兒童5種腹瀉病毒的方法建立及應(yīng)用. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2020, 38(01):15-18.

    [4] 依明·尕哈甫,王曉梅,熱娜·卡斯木等. 牛舌草多糖的含量測(cè)定以及毛細(xì)管電泳分析. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2019, 25(03):80-82.


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