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實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的實(shí)驗(yàn)步驟解析

來(lái)源：時(shí)間：2022-12-29 09:33:40 瀏覽：5630次

qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是實(shí)時(shí)熒光定量PCR。qPCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

TakaRa 試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，SYBRGreenⅠ法。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一，去除基因組DNA反應(yīng)：

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)出RNA濃度（單位ng/ul）;按照以下劑量配制10ul體系

試劑	使用量
5×gDNA Eraser Buffer	2 μl
Buffer 2.0 μl gDNA Eraser	1 ul
Total RNA	1ug/RNA濃度
RNase Free dH2O	Up to10 ul

PCR程序：42℃ 2min

4℃ ∞

二，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

按照以下劑量配制20ul體系：

試劑	使用量
步驟 1 的反應(yīng)液	10 ul
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1 ul
RT Primer Mi	1 ul
5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）	4 ul
RNase Free dH2O	4 ul
Total	20 ul

PCR程序：37℃ 15min

85℃ 5s

4℃ ∞

三，Real Time PCR

按照以下劑量配制20ul體系：

試劑	使用量
SYBR@ Premix Ex TaqII(2X）	10 ul
F Primer(10uM)	0.8 ul
R Primer(10uM)	0.8 ul
ROX Reference II	0.4 ul
反應(yīng)2的DNA模板	2 ul
ddH2O	6 ul

四，儀器設(shè)置

儀器使用的是熒光定量PCR儀Q6-96，設(shè)置界面如下圖：

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