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流式細(xì)胞儀FCM如何區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞？

來源：時(shí)間：2023-02-01 13:47:57 瀏覽：3588次

流式樣品中不可能完全去除死細(xì)胞，而在流式分析時(shí)又不希望有死細(xì)胞的干擾，所以如何在流式分析和流式分選時(shí)明確分辨死細(xì)胞就成為流式細(xì)胞術(shù)的一個(gè)重要研究內(nèi)容。目前，有四種方法供流式分析者區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞。

對角線死細(xì)胞

活細(xì)胞能產(chǎn)生非特異性熒光，只是非特異性熒光信號(hào)相對于熒光素發(fā)射的熒光信號(hào)較弱。死細(xì)胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光要明顯強(qiáng)于活細(xì)胞，有的甚至強(qiáng)于熒光素產(chǎn)生的熒光信號(hào)。非特異性熒光產(chǎn)生的熒光波長沒有選擇性，并不是局限于某一熒光波長范圍，而是處于連續(xù)的波長范圍，所以一般所有的熒光通道都能夠接收到死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號(hào)，而且其在所有波長范圍的熒光強(qiáng)度相差不多，各個(gè)熒光通道接收到的死細(xì)胞的熒光強(qiáng)度都是處于同一個(gè)等級(jí)的。在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞是位于對角線上的，而且不同的死細(xì)胞，其非特異性熒光的強(qiáng)度不同，且差異可能很大，強(qiáng)度大的可能是強(qiáng)度小的幾十倍，甚至幾百倍。所以從整體來看，死細(xì)胞的非特異性熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出從低到高的連續(xù)性分布，表現(xiàn)在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞剛好處于對角線上，如圖A所示呈線型，與活細(xì)胞群體的圓形分布有明顯區(qū)別。

對角線死細(xì)胞流式圖

7AAD標(biāo)記死細(xì)胞

7AAD(7氨基放線菌素D）是一種經(jīng)典的核酸標(biāo)記染料，在流式細(xì)胞術(shù)中能夠代替PI染料用于標(biāo)記死細(xì)胞，以去除死細(xì)胞對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波長范圍很大，常規(guī)FL1、FL2,FL3都能夠接收到其熒光信號(hào)，所以與FITC和PE熒光素發(fā)射的熒光波長有很大程度的重疊，因此，PI染料不宜與FITC和PE共標(biāo)記。而同樣標(biāo)記核酸的7AAD，其發(fā)射的熒光波長比較集中，一般被PerCP熒光通道接收，基本不與FITC和PE發(fā)射的熒光重疊，可以與FITC和PE共同標(biāo)記樣品細(xì)胞。所以，7AAD在標(biāo)記死細(xì)胞方面要明顯優(yōu)于PI染料。7AAD的熒光信號(hào)被PerCP通道接收，所以7AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標(biāo)記樣品細(xì)胞。標(biāo)記7AAD不需要與其他熒光素偶聯(lián)抗體同時(shí)標(biāo)記，只需在流式上樣前5min加入適量的7AAD于流式管中，就可上樣分析。分析時(shí)將PerCP通道陰性的細(xì)胞設(shè)門顯示于新的流式圖中即可，此時(shí)流式圖中的細(xì)胞都是7AAD陰性的活細(xì)胞。

PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞

利用PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞時(shí)，流式圖分析的順序一般是先在FSC-SSC圖中選擇目標(biāo)細(xì)胞所在的細(xì)胞群，將其設(shè)門，然后將門內(nèi)的細(xì)胞顯示于PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圈中，排除PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞代表的死細(xì)胞，將PE-Cy5陰性細(xì)胞設(shè)門，然后將門內(nèi)的細(xì)胞顯示于新的流式圖內(nèi)分析，這時(shí)該流式圖內(nèi)的細(xì)胞都是活細(xì)胞，分析或者分選時(shí)就可以盡量排除死細(xì)胞的干擾了。

PE-Cy5通道非標(biāo)記陽性細(xì)胞

EMA與ViD標(biāo)記死細(xì)胞

只標(biāo)記分析活細(xì)胞的表面抗原分子時(shí)，用7AAD鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞是理想且經(jīng)典的方法。但是如果分析胞內(nèi)分子，如檢測胞內(nèi)的重要抗原分子、胞內(nèi)細(xì)胞因子和胞內(nèi)活化的激酶等都需要先固定樣品細(xì)胞，然后用打孔劑在細(xì)胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)目標(biāo)分子結(jié)合，這時(shí)7AAD就無怯鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞了。如果在固定細(xì)胞前標(biāo)記7AAD，固定和打孔的過程可能會(huì)使7AAD發(fā)射熒光的能力丟失，如果在上樣前標(biāo)記7AAD，那所有的細(xì)胞都會(huì)被標(biāo)記，因?yàn)?/span>7AAD也可經(jīng)過小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA結(jié)合。這時(shí)，就可以用EMA(ethidiummonoazaide)和胺反應(yīng)性活性染料(aminereactiveviability dye,ViD)代替7AAD在分析胞內(nèi)分子時(shí)用于鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞。